膜片钳检测服务
1. 技术简介
膜片钳技术被称为研究离子通道的“金标准”。是当前研究细胞膜电流及离子通道的最重要的技术。从技术层面来解释的话，膜片钳技术(patch clamp)是指利用钳制电压或者电流的方法(通常为钳制电压)来记录细胞膜离子通道电活动的微电极技术。“膜片”即一片细胞膜在早期的单通道记录中是指被玻璃微电极端口吸附、记录的一小片细胞膜，这一小片细胞膜可以含有一个或几个离子通道。后来，膜片钳技术发展出多种记录构型，“膜片”即可指各种单通道记录构型中的小膜片，也可指全细胞记录构型中被检测的整个细胞膜。“钳”，即人为控制之意，根据人为控制的电学参数不同，膜片钳技术可分为电压钳和电流钳两种工作模式。电压钳(voltage clamp,VC),即人为控制细胞膜两侧的电压差(即跨膜电位)，在此条件下检测跨膜电流，具体的钳压要求视离子通道的特性而定。电流钳(current clamp，IC),则是人为控制施于细胞膜的电流，在此条件下观测跨膜电位。电压钳是膜片钳实验中常用的工作模式，它能较好的研究通道的电压依赖性，易于将其他刺激和膜电位改变引起的电学反应区分开来，在电压钳状态下记录的结果易于分析。
图1 膜片钳系统
2. 膜片钳技术的原理
膜片钳技术的原理为：用一个尖端直径在1.5-3.0um的玻璃微电极接触细胞膜表面，通过负压吸引使尖端口与细胞膜形成千兆欧姆级的阻抗封接，尖端口内的细胞膜区域与周围其他区域形成了电学分隔，然后人工钳制此片区域细胞膜的电位，即可达到对膜片上离子通道电流的监测与记录。
3. 膜片钳的工作流程
(1)制备溶液-制备细胞用的电极内液和外液;调整溶液渗透压和pH值。
(2)准备样本-准备培养细胞或脑片。
(3)拉制玻璃微电极-准备记录电极。用电极拉制仪器拉制玻璃毛细管并抛光电极尖端。
(4)设置灌流系统-确保系统处于屏蔽状态。
(5)钳制细胞-使用三维操纵器控制电极接触细胞膜。确保细胞形成高阻封接。
(6)信号采集和放大-放大信号。为了获取最佳实验结果，确保使用正确类型的放大器进行研究。
(7)信号数模转化-对模拟信号进行数字化转化，以便对信号进行分析。
(8)数据采集和分析-使用pCLAMP 11软件，根据实验目不同编程不同实验步骤，以实现更快的数据分析和精确测定。
图2 膜片钳工作流程
4. 膜片钳技术的基本记录模式
膜片钳技术共有四种基本记录模式。
(1)细胞贴附记录模式(cell-attached recording);
当用微操纵器移动玻璃电极使其尖端轻压于细胞膜后，对电极施加一个负压力，可使细胞膜陷入玻璃电极端口，与电极内壁形成"Ω"形封接，电极内部和浴液之间的电阻可达1-100GΩ，此即为吉欧封接，使被吸附的膜片与浴液之间隔开。封接紧密，即使撤去电极内的负压力，封接仍能牢固维持，这就是细胞贴附记录模式。
(2)内面向外记录模式(inside-out recording);
先形成贴附式记录构型，在此基础上将电极提起，因高阻封接使电极尖端开口边缘与细胞膜的接触相当牢固，撕下一块膜片，在低钙溶液中，此膜片原来朝向细胞质的一侧朝向浴液，即可形成内面向外记录模式。
(3)外面向外记录模式(outside-out recording);
在形成全细胞记录构型基础上，将电极提起，玻璃电极尖端周围的膜片被扯断，附着于电极的细胞膜游离边缘相互融合，细胞膜原来的外侧仍朝向浴液，即外面向外记录模式。
(4)全细胞记录模式(whole-cell recording)。
在形成贴附式记录构型的基础上，进一步对玻璃电极内施加脉动式负压力，或(和)施加适当幅度、宽度的单脉冲点击，使玻璃电极尖端吸住的膜片破裂，电极内液和细胞内部连通，这就是全细胞记录模式。
图3 膜片钳技术记录模式
5. 膜片钳技术的应用
Neher和Sakmann 在1976年发明了可用于检测细胞电生理特性的膜片钳技术。经过四十多年的发展，膜片钳技术在细胞电生理研究领域得到了广泛应用。
(1)对细胞分泌的研究;
(2)与药物作用有关的心肌离子通道研究;
(3)对离子通道生理与病理作用机制的研究;
(4)对单细胞形态与功能关系的研究;
(5)对药物作用机制的研究;
(6)在心血管药理方面的研究;
(7)创新药物研究与高通量筛选的研究;
(8)在神经科学领域中的研究。
