单细胞CRISPR筛选-武汉生物样本库有限公司-建设武汉国家级人类遗传资源库

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单细胞CRISPR筛选

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案例解析

结果展示

送样须知

Q&A

①技术介绍

单细胞CRISPR筛选（Single-cell CRISPR screening）是一种将CRISPR基因编辑技术与单细胞转录组测序（scRNA-seq）结合的高通量功能基因组学方法，能够在单细胞分辨率下系统评估基因扰动对转录组的影响。传统批量筛选（bulk screening）会掩盖细胞间差异，而单细胞CRISPR筛选技术能在单细胞水平上评估多个基因以及每个独立sgRNA在整个转录组中的扰动效应。通过单细胞CRISPR筛选，研究者能够以前所未有的精度绘制基因型-表型关系图谱，加速从基础研究到药物开发的转化。

单细胞CRISPR筛选产品的实验流程主要包括以下几个关键步骤：首先，客户需要针对目标基因设计特异性gRNA序列，随后将这些序列组装至慢病毒载体，利用组装好的慢病毒颗粒对细胞进行转染，并通过流式分选或抗性标记筛选成功转染的细胞。其次，通过10x Genomics微流控平台对筛选后的细胞进行捕获。具体原理为：油包水微滴内的凝胶微珠（Gel Beads）上的Oligo序列会特异性捕获细胞中的gRNA信息，同时基于gRNA的protospacer区域实现不同编辑序列的精准识别。这一设计使得研究人员能够在获取单细胞全转录组数据的同时，准确关联每个细胞所受到的特定基因扰动。最终通过生信分析对数据进行深度挖掘从而系统揭示基因扰动与转录组变化之间的关联。

3’CRISPR 5’CRISPR

10x单细胞CRISPR筛选原理

②技术路线

1.实验流程

10x单细胞CRISPR筛选实验流程

2.分析流程

③应用方向

1.功能基因组学研究

2.肿瘤与免疫研究

3.药物靶点发现与机制研究

4.干细胞调控研究

5.感染性疾病研究

④产品优势

1.专业流式平台支撑：配备专业流式细胞分选平台，可对慢病毒载体转染后的细胞进行高效、精准的阳性筛选，剔除未转染的无效细胞，从样本源头保障后续实验数据的可靠性与有效性；
2.高通量筛选：高通量、低成本、高灵敏度的CRIPSPR筛选同时完成对细胞间的异质性研究（一次可覆盖数万个细胞的同时筛选），一次实验活动基因功能及扰动的转录组数据；
3.经验丰富的团队：核心实验和分析团队人员稳定，深耕单细胞 CRISPR 筛选领域多年，拥有丰富的实操经验。

全基因组CRISPR筛选鉴定出可增强CAR- NK 细胞抗肿瘤效力的关键靶点
研究背景：
采用工程化自然杀伤（NK）细胞的过继性细胞疗法是癌症治疗的一种前景广阔的方法，而靶向基因编辑技术有望进一步提升其治疗效果。然而，目前仍缺乏对克服肿瘤及微环境介导的免疫抑制作用的有效遗传靶点谱的探索。我们在原代人 NK 细胞中进行了多项全基因组 CRISPR 筛选，鉴定出调控免疫抑制压力抵抗的关键检查点。敲除MED12、ARIH2和 CCNC 基因可显著增强 NK 细胞在体外和体内对多种治疗难治性人类癌症的抗肿瘤活性。 CRISPR 编辑技术同时增强了先天性和CAR介导的 NK 细胞功能，表现为代谢适应性提升、促炎细胞因子分泌增加以及细胞毒性 NK 细胞亚群扩增。通过 NK 细胞的全基因CRISPR 筛选，本研究揭示了 NK 细胞功能的关键调控因子，并为开发具有更强抗癌效果的下一代 NK 细胞疗法提供了重要资源。

技术策略：
开发 PreCiSE 高通量平台，采用逆转录病毒载体递送 sgRNA 库（含转录因子库 11,364 条 sgRNA、全基因组库 77,736 条 sgRNA），搭配 Cas9 蛋白电穿孔技术，优化电穿孔参数和筛选流程，确保 NK 细胞编辑效率（如 CD45 敲除效率达 90.1%）和存活度。以脐血来源的原发性人类 NK 细胞为研究对象，通过工程化通用抗原呈递细胞（uAPCs）联合 IL-2 进行体外扩增，维持细胞活性和筛选覆盖度（≥500 倍）
设置转录因子库筛选、肿瘤反复刺激筛选、脱颗粒功能筛选、TME 免疫抑制压力（如 TGFβ、乳酸、缺氧等）筛选等多组实验，覆盖 NK 细胞增殖、细胞毒性、抗耗竭等关键功能维度。通过流式细胞术、质谱流式细胞术（CyTOF）、单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）、代谢分析、体内外肿瘤杀伤实验等，验证候选靶点的功能及机制。

研究成果：

如图(A)所示，通过全基因组 NK 细胞 Capan-1 肿瘤反复刺激筛选，分析中介体复合物各功能结构域的基因对 NK 细胞的 “必要性”—— 即这些基因被敲除后，NK 细胞在肿瘤压力下的存活功能优势变化。激酶模块（CKM）相关基因（如 MED12、CCNC）的 sgRNA 丰度显著升高，提示敲除这些基因能增强 NK 细胞抗瘤能力，是关键调控靶点。

如图B所示，通过 CRISPR-RNP（Cas9 蛋白与 sgRNA 形成的核糖核蛋白复合物），特异性靶向中介体复合物的激酶模块（CKM）中的 MED12 基因，实现该基因的精准敲除，从而破坏 CKM 的功能，观察 NK 细胞功能变化。

如图D所示，采用 xCELLigence 实时细胞分析技术，动态监测 PATC148 胰腺癌细胞的生长情况 ——NK 细胞杀伤能力越强，肿瘤细胞生长越慢，曲线越低。

统计结果显示非配对 t 检验显示p<0.01（差异显著），通过 “肿瘤生长曲线下面积（AUC）的倒数” 量化 —— 倒数越大，说明肿瘤生长被抑制越明显，即 NK 细胞杀伤能力越强。MED12 敲除后，NK 细胞对 PATC148 胰腺癌细胞的杀伤能力显著提升。

参考文献：

Biederstädt, Alexander et al. “Genome-wide CRISPR screens identify critical targets to enhance CAR-NK cell antitumor potency.” Cancer cell, S1535-6108(25)00327-7. 18 Aug. 2025, doi:10.1016/j.ccell.2025.07.021

单细胞CRISPR筛选送样标准
样本要求
①新鲜细胞，细胞活率＞80%

②细胞直径＜40μm

③细胞总量＞30万

④无支原体细菌污染

⑤不含Ca²⁺/Mg²⁺、EDTA、DMSO、RNase、逆转录抑制剂

运输要求
2–8℃冰上运输，样本管套入气泡袋/泡沫套，避免与冰袋直接接触（防局部冻损），样本居中，周围填冰袋与缓冲物，严禁常温、干冰、-20℃、反复冻融。提前24–48 h预约实验室，确认接收时间与人员。

Q1：选择3’还是5’ CRISPR筛选？

A1：10x Genomics目前提供两款高通量且可扩展的单细胞CRISPR筛选产品，这些产品能够实现单细胞表达分析，并结合Feature Barcode技术进行CRISPR筛选。

就基因表达和向导捕获而言，3’和5’ CRISPR筛选分析的灵敏度相当。在大多数情况下，客户应考虑5’ CRISPR分析。以下标准可帮助您确定哪种分析最适合您的实验。

如果满足以下标准，客户应选择5’ CRISPR分析：

（1）已拥有一个构建好的、兼容的向导RNA文库，希望在单细胞CRISPR筛选流程中使用。

（2）单细胞CRISPR筛选的新手。

（3）在单细胞CRISPR筛选方面经验丰富，但不希望加入额外的步骤，采用分析特异性的序列来修饰向导文库。

如果满足以下标准，客户应选择3’ CRISPR分析：

希望将单细胞CRISPR实验的数据与之前使用3’分析的实验进行比较。建议使用相同的CRISPR分析，以便最大限度减少批次效应。

Q2：5’ CRISPR筛选所用的方法是否可应用于3’方法，这样后者就不需要用捕获序列来检测向导？

A2：由于逆转录酶具有方向性，这种做法不可行。不过，这两种分析的流程非常相似，灵敏度也相当，因此选择5’方法没什么缺点。但如果您对3’分析有着明显的偏好，MilliporeSigma公司能够提供与3’ 分析兼容的质粒。

Q3：在使用单细胞5’ CRISPR筛选时，如何扩展到数千个基因？

A3：对于均质的样本类型，我们建议为每个基因规划约100个细胞，以便您的实验有足够的统计能力。因此，若希望扩展实验，在单个项目中检测数千个基因，那么您只需要扩展细胞数量即可。例如，采用我们5’分析的高通量实验运行每次可分析320,000个细胞，这就足以检测3,200个基因。

Q4：10x CRISPR筛选技术与CROP-seq或Perturb-seq相比有优势吗？

A4：Perturb-seq是通过检测表达框中单独的向导条形码序列来间接捕获向导RNA数据的，该序列是多聚腺苷化的。由于向导条形码与对应的sgRNA往往相距几千个碱基，因此可能发生病毒重组介导的条形码与sgRNA交换，导致数据准确性降低。10x Genomics的方法则是直接捕获向导RNA序列，而不是推断的，因此在使用我们的分析时不用担心。