蛋白定量-武汉生物样本库有限公司-建设武汉国家级人类遗传资源库

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蛋白定量

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送样须知

Q&A

①技术介绍

蛋白定量常分为DDA（数据依赖型采集）DIA（数据非依赖型采集），与传统的shotgun技术相比，DIA采集模式能够将扫描区间内所有的肽段母离子经过超高速扫描并进行二级碎裂，从而获得完整的肽段信息。DIA相比于传统DDA的最大的优势在于高效测定复杂样品中相对低丰度的蛋白分子，极大地提高了定量分析的可信度。而且样本无需分级上机，极大的缩短了每个样品的检测时间，适合大样本量的蛋白质组研究。

②技术路线

③产品优势

1.采集一级质谱full scan的全部母离子及对应的二级质谱子离子信息，具有更高的数据覆盖度

2.二级质谱分“窗口”进行数据采集，减少数据采集的随机性，具有更高的检测重现性和稳定性，适用于大批量样品的蛋白质组学分析

3.依靠多个循环的多个子离子对蛋白质进行定量，定量精密度、准确性、线性范围大大提高

4.检测产品：非标记蛋白定量、DIA 蛋白定量、TMT标记蛋白定量、PRM蛋白绝对定量、蛋白翻译后修饰定量

不同孕龄人类新生儿胎粪中宿主来源的蛋白质图谱研究
研究背景：
胎粪是胎儿出生后首次排出的粪便，反映了产前胃肠道的物质积累，是研究新生儿健康状况的非侵入性生物材料。然而，不同孕龄阶段胎粪的蛋白质组成及其与疾病的关系尚不明确。该研究旨在通过DIA蛋白质组学分析，揭示胎粪中宿主来源蛋白质的动态变化，为新生儿胃肠道疾病、先天性心脏病等疾病的诊断和病理机制研究提供依据。

研究方法：
研究团队对259名新生儿（包括163名早产儿）的首次胎粪样本进行数据非依赖性采集（DIA）蛋白质组学分析，鉴定出5370种人源蛋白质，并聚焦于在至少100个样本中检测到的3433种蛋白质进行深入分析。同时，结合基因集富集分析（GSEA）、无监督层次聚类等方法，探究蛋白质与胎龄、性别及疾病的关系。

首次胎粪的数据非依赖型采集(DIA)蛋白质组分析

研究成果：
1.蛋白质来源与功能：胎粪中的蛋白质不仅来自胃肠道，还涉及多种组织（如肝脏、肾脏、免疫系统等），具有参与细胞代谢、信号转导、免疫调节等多种生物学功能。
2.性别差异：女性新生儿胎粪中67种蛋白质显著富集，主要与鳞状上皮组织（如食管、阴道、皮肤等）相关；男性新生儿中10种蛋白质更丰富，与小GTP酶信号转导等过程相关。
3.胎龄相关变化：随着孕周增加，1158种蛋白质表达水平下降，348种蛋白质上升。早产儿胎粪中细胞外基质蛋白（如层粘连蛋白、整合素等）和特定粘蛋白（如粘蛋白-5ac、粘蛋白-16）表达升高，可能与肠道发育不成熟或疾病风险相关。
4.该研究为新生儿胃肠道健康评估提供了新的生物标志物和检测方法，有助于早期识别疾病风险、指导临床干预，并为理解新生儿疾病的病理生理机制提供了新视角。

参考文献：

Shitara Y, Konno R, Yoshihara M, et al. Host-derived protein profiles of human neonatal meconium across gestational ages. Nat Commun. 2024;15(1):5543. Published 2024 Jul 17. doi:10.1038/s41467-024-49805-w

蛋白质组学（质谱）服务项目对样品量的要求
①银染或考染胶条：需条带肉眼清晰可见；
②细胞：蛋白质组学项目需至少1×10⁶个细胞；磷酸化蛋白质组学项目需至少1×10⁷个细胞；
③动物组织：蛋白质组学项目需鲜重 100mg；磷酸化蛋白质组学项目需 500mg；
④植物组织：蛋白质组学项目需鲜重 200mg；磷酸化蛋白质组学项目需 1g；
⑤微生物：菌体沉淀>200mg；修饰蛋白组学>1g；
⑥体液：血浆/血清>100μL；修饰蛋白组学>300μL；
⑦外泌体：需要自行抽提外泌体后自行进行 WB，NTA 等指标检测，并建议测定样本蛋白浓度，尽量保证蛋白量大于 200ug 蛋白/样，样本-80℃保存，足量干冰寄送。血清/血浆外泌体（需要的血清/血浆初始体积）-定量蛋白组学>1ml，细胞上清外泌体（需要的细胞上清初始体积）-定量蛋白组学>50ml；
备注：对于蛋白得率较低的样品，建议在条件允许的情况下，适当提高样品送样量；特殊样品，请联系公司技术人员协商送样量。

常见类型样品的准备流程
①胶条样品：将蛋白条带用干净的刀片切下，并切割为 1mm3 的小块，装入进口 EP 管中及时送样，送样时需加冰袋维持低温；
②蛋白溶液样品：最好测定蛋白浓度后，干冰寄送液氮速冻的蛋白溶液（需指明缓冲液成分和浓度）；或将蛋白通过 TCA 法或丙酮法沉淀，晾干后，干冰或冰袋寄送；
③细胞、细菌、真菌样品：用预冷的 PBS 缓冲液清洗三次，去除培养基残留成分，清洗结束后，离心将上清弃去，液氮速冻后，-80℃保存，或干冰寄送；
④动物组织样品：取材后冰上操作，迅速将组织剪成长宽高分别为 0.5cm 的小块，用预冷 PBS 清洗三遍，去除残留血液，称重后，液氮速冻，-80℃保存，或干冰寄送；
⑤植物组织样品：新鲜取材后，用预冷的 PBS 将材料表面污物去除，称重后，液氮速冻，-80℃保存，或干冰寄送；
⑥培养基上清液：培养细胞至合适密度，用无血清培养基清洗三遍后，加入无血清培养基继续培养合适时间，收集培养上清，离心去除细胞后，使用 0.22μm的滤膜过滤，液氮速冻后，-80℃保存，或干冰寄送；
⑦血液样品：血液样品一定避免溶血，要求采集血液时同时制备为血清或者血浆样品，建议使用相应的采血管，之后通过离心的方式获得血清或血浆，按需求分装后，液氮速冻，-80℃保存，或干冰寄送；
⑧IP 样品：关于IP样品制备与注意事项，可向公司索取《IP-MS 送样指南》。

Q1：全谱分析和定量分析一般能鉴定到多少蛋白？

A1：全谱分析和定量分析它们分别能鉴定到的蛋白数，跟样品的复杂度和样品制备方法、仪器性能等因素有关。一般情况下，常规样本全谱分析鉴定通量为1000～3000个蛋白，而定量蛋白质组学鉴定通量为2000～6000个蛋白。

Q2：IP样品的鉴定，若质谱未鉴定到目标蛋白，是什么原因导致？该怎么办？

A2：因抗体质量问题，IP实验本身存在假阳性，此种情况质谱能检测到目标蛋白的概率较低；若IP实验没问题，但质谱未鉴定到目标蛋白的可能原因有：①目标蛋白与抗体结合不强，IP洗脱时因太过剧烈导致实际结合的目标蛋白非常少，达不到质谱要求的灵敏度；②样品中存在高丰度污染蛋白，其信号覆盖了目标蛋白的信号，导致未能鉴定到。解决方案：调整IP实验，如更换抗体（不同厂家更换）、改变洗脱策略（由剧烈变缓和），实验过程严格控制操作环境，避免引入大量污染蛋白。