蛋白质定性分析服务_武汉生物样本库有限公司 -建设武汉国家级人类遗传资源库

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蛋白质定性分析服务

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蛋白质定性分析服务

产品描述

案例解析

结果展示

送样须知

Q&A

　　a.蛋白质全谱分析

　　蛋白质全谱分析也可称为质谱shotgun分析，指的是组分分析，研究对象是完整的组织、体液或其提取物，其目的在于鉴定出尽可能多的肽和蛋白质分子。蛋白质质谱鉴定的基本原理是用蛋白酶将蛋白质消化成肽段混合物，用电子轰击或者其他方式使其离子化，形成不同质荷比的带电离子，然后通过质量分析器将具有特定质荷比的肽段离子分离开来。通过实际谱图和理论上蛋白质经过蛋白酶消化后产生的一级质谱峰图和二级质谱峰图进行的比对，从而进行蛋白鉴定。

蛋白质全谱分析示意图

　　使用仪器：THERMO: Orbitrap Eclipse、Orbitrap Exploris 480、Q Exactive plus; AB SCIEX: TripleTOF 5600 plus。

　　技术优势：可全面鉴定整个细胞、组织或复杂混合样品中的大量蛋白质，可鉴定200-5000个蛋白。

　　应用领域：某一生理状态下组织、细胞或者细胞器中所有表达蛋白质的鉴定。

　　样品要求：

样品	样品要求
蛋白质溶液	蛋白质总量>500μg，浓度>0.1μg/μl；缓冲液不含去污剂NP40、Triton X-100等

　　项目周期:

进展	时间周期
收样/质控	2-3个工作日
样品处理	4-5个工作日
质谱上机	2-3个工作日
数据分析	2-3个工作日
总计	不超过15个工作日

　　备注：超过5个样本每增加1个增加3个工作日，如需加急请联系我方协商处理。

　　b.蛋白质胶条/混合液鉴定

　　利用LC-MS/MS技术对单一胶条(即SDS-PAGE样本)、IP、Co-IP、Pull-down纯化溶液等中等复杂样本进行蛋白鉴定。

凝胶电泳条带鉴定路线图

pull-down实验路线图

　　使用仪器：THERMO ：Orbitrap Eclipse 、Orbitrap Exploris 480、QE plus 高分辨质谱。

　　技术优势：高灵敏度，高准确性。适合中度复杂的蛋白质样品，如相互作用的蛋白质条带。

　　应用领域：疾病标志物研究，作用机制研究，植物抗逆研究，药物作用靶点研究，特殊功能蛋白质鉴定。

　　样品要求：

样品	样品要求
SDS-PAGE条带	考染、银染（质谱兼容）条带清晰可见
蛋白质溶液	蛋白质总量>5μg，浓度>0.1μg/μl；
蛋白质溶液	缓冲液不含去污剂NP40、Triton X-100等

　　项目周期：

项目流程	服务周期
收样/质控	1-2个工作日
样品处理	2-3个工作日
质谱上机	2-3个工作日
数据分析	2-3个工作日
报告编写	1-2个工作日
总计	不超过10个工作日

　　备注：超过10个样本每增加1个增加1个工作日，如需加急请联系我方协商处理。

　　案例一沙门氏菌中PhoP依赖于酪氨酸磷酸化的降解机制

　　项目简介

　　研究材料用的是一种革兰氏阴性菌。细菌中有一类非常著名的感应外界信号并作出应答的系统，被称为二元调控系统。二元调控系统信号传导的基础是蛋白磷酸化。以其中最关键的PhoP/PhoQ系统为例，细胞膜上的感应蛋白PhoQ感受外界信号的刺激，发生自磷酸化，接着将磷酸根转移至调节蛋白PhoP上的特定天冬氨酸位点上，从而激活它。磷酸化的PhoP就可以调控下游一系列基因的表达，包括很多与细菌致病与毒力相关的基因。

PhoP/PhoQ调节系统示意图

　　项目流程

　　a.磷酸化位点的鉴定

　　为了鉴定PhoP蛋白上其他可能的磷酸化位点，首先IP纯化了过表达的PhoP，然后胶内酶解为肽段，通过质谱分析，发现PhoP上的一个酪氨酸磷酸化位点。这张二级质谱图包含丰富的碎片离子和酪氨酸磷酸化的特征亚胺离子(216.043)，确定了该磷酸化位点。

图 PhoP磷酸化位点的鉴定

　　b.双甲基化定量分析

　　利用基于双甲基化的定量蛋白质组学技术研究这个酪氨酸磷酸化对细菌的蛋白质组产生了哪些影响。典型的定量蛋白质组学的流程：培养野生型CmP菌株、模拟磷酸化的YD突变株、模拟非磷酸化的YF突变株，然后提取蛋白，酶解为肽段，双甲基化标记分别标记为轻中重，等比混合后，进行质谱检测和定量分析。

双甲基化定量分析

　　c.结果分析

　　在两组生物学重复中，共同定量到了约1600个蛋白，其中上调的有200个，下调的有274个。相关性分析表明，两次之间的重复性很好。

数据概述

　　把文献中已报道的PhoP激活的蛋白的定量信息提取出来，做了这样一个热图(如下图)，可以看出他们都在模拟磷酸化的菌株中显著下调了，而在模拟非磷酸化的YF菌株中基本没有变化。

图已知的PhoP激活的蛋白

　　在检测PhoP和PhoQ蛋白水平和mRNA水平上的变化时，发现模拟磷酸化的Y到D突变后，PhoP在蛋白水平降低的程度远远大于PhoQ，而在mRNA水平上，两者的变化差别不大。

　　通过体内蛋白的降解实验发现，PhoP在YD突变后，蛋白发生了降解。由下图可以看到，随着时间的变化，只有模拟磷酸化的YD突变发生了降解，而野生型PhoP、模拟非磷酸化的YF突变，以及同样会造成PhoP蛋白失活的D52A突变，都没有降解现象发生。

体内蛋白的降解实验

　　有功能的PhoP对细菌在抗病菌多肽环境中的生长和生存至关重要。从这个实验可以看出，模拟磷酸化的YD突变和PhoP失活的PhoP-菌株一样，对抗病菌肽的抵抗能力显著下降。

抗病菌肽抵抗实验

　　d.研究结论

　　最后是一个简单的模式图，作为对以上这些发现的总结。当PhoP上已知的经典的D52被PhoQ磷酸化时，PhoP被激活而发挥重要的调控作用。而当这个Y位点被某个激酶磷酸化时，PhoP则会被降解掉，从而失去调控活性。

PhoP降解模式图

　　1.蛋白质组学项目服务流程

　　2.蛋白质组学样品准备的一般原则

　　a)确保样品状态良好，符合预期的表型或分子指标。

　　b)带手套、口罩、头套进行操作，避免角蛋白污染。

　　c)保证取材后的操作在冰上进行，并尽量操作迅速。

　　d)依后续实验需求，做好分装，避免蛋白反复冻融。

　　e)取材后，液氮速冻，- 80 ℃ 冰箱保存，干冰寄送。

　　3.蛋白质组学服务项目对样品量的要求

样本类别	样本规格
银染或考染胶条	需条带肉眼清晰可见
细胞	蛋白质组学项目需1×10⁶或体积>30 μL；磷酸化蛋白质组学项目需1×10⁷
动物组织	蛋白质组学项目需鲜重100 mg；磷酸化蛋白质组学项目需500 mg
植物组织	蛋白质组学项目需鲜重200 mg；磷酸化蛋白质组学项目需1 g

备注：对于蛋白得率较低的样品，建议在条件允许的情况下，适当提高样品送样量；特殊样品，请联系公司技术人员协商送样量。

　　4.蛋白质组学服务项目样本寄送指南

样本类型	样本寄送要求
胶条样品	将蛋白条带用干净的刀片切下，并切割为1 mm³的小块，装入进口EP管中及时送样，送样时需加冰袋维持低温。
细胞、细菌样品	需用预冷的PBS缓冲液清洗三次，以去除培养基的成分，清洗结束后，离心将上清弃去，液氮速冻后，干冰寄送。
动物组织样品	取材后冰上操作，迅速将组织剪成0.5 mm³的小块，用预冷的PBS清洗三遍，去除残余的血液，称重后，液氮速冻，干冰寄送。
植物组织样品	取材后，用预冷的PBS将材料表面的污物去除，称重后，液氮速冻，干冰寄送。
蛋白溶液样品	最好测定蛋白浓度后，干冰寄送冻存的蛋白溶液（需指明缓冲液成分和浓度）；或者将蛋白通过丙酮法沉淀下来，晾干后，干冰或冰袋寄送蛋白沉淀。
培养基上清	培养细胞至合适密度，用无血清培养基清洗三遍后，加入无血清培养基继续培养合适时间，收集培养上清，离心去除细胞后，使用0.22 μm的滤膜过滤，液氮速冻，干冰寄送。
血液样品	血液样品一定避免溶血，要求采集血液时同时制备为血清或者血浆样品，建议使用相应的采血管，之后通过离心的方式获得血清或血浆，按需求分装后，液氮速冻，-80℃冰箱保存，干冰寄送。
磷酸化样品	用于磷酸化分析的样品，处理样品过程中保持低温，裂解液中需添加蛋白酶抑制剂和磷酸化酶抑制剂。