流式分选-武汉生物样本库有限公司-建设武汉国家级人类遗传资源库

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流式分选

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案例解析

结果展示

送样须知

Q&A

①技术介绍

流式分选在流式分析的基础上，能将感兴趣的目标细胞“挑拣”出来，作为后续培养扩增、蛋白鉴定、测序等实验操作的素材。对于分选的挑战，除了需要快速准确分选外，还要使获得的细胞具有高活力、高纯度、高回收率。

基于单细胞测序、Smart-Seq2、RNA Seq等测序的细胞原材料获取，高效筛选高活率、高纯度目的细胞，流式分选方式最为可取。联合公司测序、单细胞测序、蛋白组学及生信平台，可实现从原材料到出具报告的一站式服务。

②技术路线

单细胞制备-流式染色-分选仪器质控-流式分选-细胞纯度验证-（单细胞测序+ Smart-Seq2+RNA Seq+WB+BCR测序等等）

③产品优势

1.高通量筛选：流式分选技术可在单次实验中处理上亿个细胞，可帮助研究者从庞大的抗体库或细胞群中快速锁定目标细胞

2.高精度分选：通过多参数荧光抗体标记，流式分选可精准识别并分离单个目标细胞

3.高纯度分选：分选细胞纯度超95%以上，还能维持细胞活性，适配后续各种实验

4.单细胞多组学整合：分选后的单细胞可直接用于下游全基因组测序、单细胞转录组测序和蛋白组学检测等等，多组学结合将实现“单细胞制备-流式分选-多组学检测-数据分析”的闭环

④服务内容

样本制备	项目内容	服务周期
细胞原材料获取	全血PBMC分离	1-3个工作日
细胞原材料获取	组织单细胞悬液制备	1-3个工作日
流式分选	稳转细胞系筛选	1-3个工作日
	抗原特异性B细胞筛选	1-3个工作日
	细胞核分选	1-3个工作日
	分选目的细胞用于下游测序、单细胞测序、蛋白组学等	1-3个工作日
整体项目	实验设计到数据报告	一项一议

阐明单核细胞样髓源抑制细胞的功能异质性以预测脓毒症预后
研究背景：
脓毒症被定义为宿主对感染反应失调引起的危及生命的器官功能障碍，其中脓毒性休克（SS）是其严重形式，病死率极高。据估计，全球每年约有4,900万脓毒症病例，导致约1,100万人死亡，占全球总死亡人数的19.7%。脓毒症的免疫病理特征以过度炎症反应与免疫抑制并存为核心。在这一过程中，单核细胞扮演了关键角色，早期被激活后释放大量促炎细胞因子（如IL-1β、IL-6、TNF-α），随着病程进展则分化为具有免疫抑制功能的单核髓源性抑制细胞（M-MDSCs），其特征是MHC II类分子（HLA-DR）表达下调及抗原提呈能力下降。然而，M-MDSCs在脓毒症中的表型标记、功能异质性及其临床意义仍存在诸多争议与未知。尽管传统M-MDSCs表型定义为CD33+CD11b+CD14+CD15-HLA-DRlow，但这些标记尚无法明确区分抑制性M-MDSCs与稳态单核细胞。此外，M-MDSCs的功能随病程演变而变化的特性，使得理解其临床意义面临巨大挑战。为突破这些困境，本研究旨在利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，深入表征脓毒症患者中M-MDSCs的表型和功能异质性。

研究方法：
研究纳入195例脓毒症患者，分为非脓毒性休克（NSS）、脓毒性休克存活组（SS/survival）与死亡组（SS/decease）。通过流式细胞术分选HLA-DRlowCD14+与HLA-DRhighCD14+单核细胞，进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）及功能验证。同时，结合转录组、代谢组、细胞耗氧率及细胞共培养实验，系统分析M-MDSCs的异质性、功能特征及代谢调控机制。

研究结果：
流式分选+scRNA-seq揭示脓毒症单核细胞的异质性图谱：UMAP分析将CD14+单核细胞分为9个簇，包括初始单核细胞、IFN-γ刺激单核细胞、CD16+单核细胞、促炎单核细胞及M-MDSCs等。HLA-DRlowCD14+单核细胞中M-MDSCs比例显著升高，且高表达RETN、低表达HLA-DPB1。

研究结论：

本研究首次基于scRNA-seq将脓毒症M-MDSCs划分为3个功能亚群，阐明其从早期促炎（S100A亚群）向晚期免疫抑制（THBS1与IL1R2亚群）的动态演变。VSIG4被鉴定为THBS1_M-MDSC的特异性功能标志物，且其与IL1R2的联合检测在脓毒症预后预测中表现出优越性能。该研究为理解脓毒症免疫抑制机制提供了新视角，并为临床预后评估与靶向治疗提供了潜在标志物。

参考文献：

Tang G, Xing W, Zhu L, et al. Illustrating the functional heterogeneity of M-MDSCs to predict sepsis outcomes. Journal of Advanced Research. Advance. 2026 Jan 3:S2090-1232(26)00008-1.

流式分选送样标准
细胞样本
1.样本类型：贴壁细胞、悬浮细胞、冻存细胞、固定后的细胞；
2.样本数量：检测表面蛋白时，细胞数量为1×10⁶以上；检测胞内或核内蛋白指标时，细胞数量为3×10⁶以上；若项目检测涉及多个指标，在首次送样时，除开检测样本，还需额外提供5×10⁵个细胞/指标*n（指标数）的细胞量，用于检测方案设置。

血液样本
1.样本类型：来源于人或动物（小鼠、大鼠等）的血液样本；
2.样本数量：
①采用裂红的方法检测表面蛋白时，每个样本体积不少于100μL；
②采用裂红的方法检测胞内或核内蛋白指标时，每个样本体积不少于300μL；
③采用密度梯度离心的方法检测表面蛋白时，每个样本体积不少于1mL；
④采用密度梯度离心的方法检测胞内或核内蛋白时，每个样本体积不少于3mL；
在首次送样时，除开检测样本，还需额外提供单个样本体积*n（指标数）的样本量用于检测方案的设置。

组织样本
1.样本类型：来源于人或动物（小鼠、大鼠等）的脾脏、淋巴结、肺、皮下瘤等；
2.样本数量：新鲜组织不小于黄豆大小，对于目的细胞含量较低的组织类型，需要根据首次实验评估后的结果，加大样本的送样量。
在首次送样时，除开检测样本，还需额外提供部分组织样本用于检测方案的设置。

其他体液样本
1.样本类型：来源于人或动物（小鼠、大鼠等）的腹水、脑脊液、血清、血浆、细胞培养上清等；
2.样本数量：
①若样本用于细胞水平流式检测，细胞量需满足样本数量要求；
②若样本用于Elisa检测，单个指标所需样本体积需不少于100μL；
③若样本用于液相细胞因子检测，单个试剂盒所需样本体积不少于50μL；

植物样本
1.样本类型：植物叶片、根、茎等。除了待测目标样本，倍性检测须提供同源近亲物种做参照样本。基因组大小检测需提供已知基因组大小的同源近亲物种做参照，也可提供已知且稳定的基因组大小物种做参照，如拟南芥等。
2.样本数量：叶片大小按1cm×1cm评估，大概10片左右。其他类型需至少3g以上新鲜的组织。

样本处理及运输
1.细胞样本
①贴壁细胞：对于贴壁培养的细胞，运送前，需培养瓶内加满细胞培养液，拧紧瓶盖，加冰袋24h内运输至实验室，运输过程做好物理隔离，避免低温产生冰渣。样本运输至实验室时，冰袋未完全化冻；
②悬浮细胞：对于悬浮培养的细胞，运送前，需将培养基中的细胞转移至密封性较好的离心管中，拧紧盖子后，加冰袋24h内运输至实验室，运输过程做好物理隔离，避免低温产生冰渣。样本运输至实验室时，冰袋未完全化冻。不要采取多孔板送样，运输时，容易因为晃动造成孔间污染；
③冻存细胞：对于冻存的活细胞，采用干冰寄送。需保证在样本运输至实验室时，干冰未完全挥发，并完整覆盖样本，样本本身没有融化现象；
④固定后的细胞：对于处理后，需要对细胞及时固定的项目，可以将细胞悬液350g，离心5min，弃上清；加入1mL的4%多聚甲醛固定液，混匀。转移至1.5mL的离心管，室温固定15~20min，400g，离心5min，弃上清；PBS洗涤一次后，用1mL的PBS重悬，混匀，盖紧，加冰袋运输至实验室，运输过程做好物理隔离，避免低温产生冰渣。样本运输至实验室时，冰袋未完全化冻；

2.血液样本
①若样本用于检测表面蛋白，则EDTA和肝素抗凝剂两种都可使用。
②若样本用于胞内或核内蛋白因子检测，则建议使用肝素抗凝剂。
③采血后，充分混匀，避免出现凝血的现象。加冰袋24h内运输至实验室，运输过程做好物理隔离，避免低温产生冰渣。样本运输至实验室时，冰袋未完全化冻；

3.组织样本
①组织样本采集后，对于体积较大的组织，需将组织剪成黄豆大小的块状，用PBS或生理盐水冲洗后，快速转移至组织保存液中，需保证组织保存液完全浸润组织样本。
②加冰袋48h内运输至实验室，运输过程做好物理隔离，避免低温产生冰渣。样本运输至实验室时，冰袋未完全化冻，样本完全浸润在组织保存液中。

4.其他体液样本
①若直接送检腹水或脑脊液样本，需在样本采集后，4h内运送至我方实验室。加冰袋运输，运输过程做好物理隔离，避免低温产生冰渣。样本运输至实验室时，冰袋未完全化冻。
②若直接送检血清、血浆、细胞培养上清等，在收集样本后，需及时将样本放在-80℃冰箱中冻存。采用干冰寄送，需保证在样本运输至实验室时，干冰未完全挥发，并完整覆盖样本，样本本身没有融化现象；

5.植物样本
①样本采集后，需尽快用打湿的纸包裹，自封袋封装，并在袋子上做好对应的标记；
②若为寄生培养的植物，建议带盆整株送检；加冰袋运输，运输过程做好物理隔离，避免低温冻上植物样本。样本运输至实验室时，冰袋未完全化冻。

Q1：分选时，液滴延迟的校准为什么如此关键？

A1：液滴延迟是指细胞通过激光检测点后，形成液滴并到达充电点的时间。这个时间差的计算必须极其精确。如果延迟设置不准确，充电脉冲就会打在错误的液滴上，导致想分选的细胞被当成废液排走，而不想要的细胞却被收集。因此，每次分选前都必须使用微球进行精确校准。

Q2：如何平衡分选纯度、得率？

A2：这两者往往相互制约，需要根据实验目的权衡。纯度优先时可以采用单细胞模式或更严格的设门策略，确保分选出的细胞几乎100%是目标细胞，但可能损失得率。得率优先时可以采用富集模式，加快分选速度，优先保证获得足够数量的细胞，但纯度可能会略有下降。

关键词：

流式分选