纯测序散样/包lane/包FC-武汉生物样本库有限公司-建设武汉国家级人类遗传资源库

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纯测序散样/包lane/包FC

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送样须知

Q&A

技术介绍

外源文库纯测序服务专为已完成样品前处理并自行构建好文库的客户提供。使用先进的高通量测序技术，能够在短时间内为纯测序客户生成高质量的测序数据，确保研究项目能够及时获得可靠的结果。

纯测序送样标准
Illumina平台测序文库
1. 结构序列：送测的文库需结构序列无问题，能够在Illumina平台正常测序（可提前将文库序列结构发送给我们评估）
2. 体积要求：＞15ul
3. 浓度要求：QPCR浓度>3M（QPCR为相对定量，标准品不同检测的浓度会有差异，文库实际QPCR浓度会以我方实验室检测的浓度结果为准）
4. 片段大小：Illumina建议novaseq测序的文库插入片段长度不超过500bp，片段太长会有质量产量偏低的风险；片段质检合格要求：质检片段分布在预期范围内，峰型单一、无杂峰，无接头、引物二聚体污染及拖尾等

华大平台测序文库
1. 文库类型：T7平台适合基因组、转录组、外显子等常规文库进行测序，碱基不平衡文库（small RNA、甲基化）不建议在T7平台进行测序
2. 建库：请使用商业化试剂盒进行操作，文库结构序列无问题、可以在T7平台使用通用测序引物正常测序。建议使用带双barocde的接头，按照barcode说明书进行使用
3. 文库质量：文库插入片段建议300-350bp，片段分布图主峰呈正态分布、峰型单一明显、无杂峰，无接头、引物二聚体污染及拖尾等，双链文库总量≥400ng

Q1：二代测序错误率为什么开始和末期会升高？

A1：测序错误率用E表示，碱基质量值用Q表示，Qphred=-10log10（e）Q30/Q20对应碱基正确率99.9%和99%。

一般测序片段前段几个bp以及片段末端的错误率会偏高；测序错误率会随片段长度增加而升高，这是由于化学试剂消耗造成的，是Illumina平台的共有特征。（非常规片段文库测序质量Q20、Q30会降低一些）。

Q2：文库库检出现接头污染/含小片段如何处理？

A2：对于接头污染或引物二聚体污染可用磁珠纯化加以处理，而小片段文库只能切胶纯化，纯化效率一般在30%左右，风险比较高。

Q3：数据中的 Duplication 指什么?如何定义?有何影响？

A3：生物学意义:由同一个序列经过PCR扩增而产生的不同的reads，处理的时候去掉这些不同的reads只留一条。生物信息学上意义:跟比对软件有关; 严格定义:起始和终止坐标都一样，mismatch 的位置和类型都一样的不同的reads，算duplication; 宽松定义:起始坐标一样的不同的reads，定义为 duplication。位点一样，碱基也一样的就是确定的 duplication; 而那些过滤了 adaptor 之后的信息（起始终止坐标，mismatch 位置，类型等）一样的不同 reads 不一定就是duplication，因为没有算上去掉的那一部分。Duplication与测序深度可能有关系，理论上，测序深度越高，得到的 duplicate 的 reads 也会越多，因为这些 reads 也会比对到基因组上，在 call SNP 的时候，会对局部的覆盖深度有影响，甚至于影响到 SNP 的进一步过滤，所以对于变异的检测也是有干扰的；对于InDel 和 SV 也是类似的。